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鱼类出血性疾病的发病机制与防控关键技术

2016年01月15日   来源:当代水产   浏览:1272

  鱼类出血性疾病是我国淡水池塘鱼类养殖中危害种类最多、流行地区最广、发病率最高、经济损失最大的一类疾病。鱼类出血病是指由致病因子引起的以出血为特征的一类鱼病,致病因子一般包括细菌、病毒、寄生虫、应激和药物中毒等多种因素。因此本文就鱼类出血性病有关的病理学概念和发病机制做了简要介绍,并根据不同病因和症状提出了鱼类出血性疾病不同的防治方案,以期为临床上更好的研究和防治该类疾病提供基础。

  1 出血和出血病概述

  1.1 出血和鱼类出血病概念

  血液自心和血管的腔隙中流出的现象,称为出血。流出的血液进入体腔或组织内则称为内出血,反之为外出血。异育银鲫的“鳃出血”病最为典型的症状即为鳃部外出血,而罗非鱼链球菌则能引起肝脏的内出血。按照血液逸出的机制可将出血分为破裂性出血和漏出性出血两种。鱼类破裂性出血的原因有机械性创伤,如刺伤或咬伤;有侵蚀性损伤,如炎症、肿瘤、溃疡、坏死等过程。漏出性出血是由于毛细血管后静脉、毛细血管以及毛细血管前动脉的血管壁通透性增高,血液通过扩大的内皮细胞间隙和受损的血管基底膜而漏出于管腔外的。

  鱼类皮肤、黏膜、浆膜和实质器官的点状出血所形成的瘀点或瘀斑则是漏出性出血的表现,如鳗鲡红点病、嗜水气单胞菌、鱼类应急性出血症等。除感染引起的鱼类漏出性出血外,其它引起鱼类漏出性出血的常见病因还有:维生素C等缺乏引起血管基底膜破裂;毛细血管胶原减少可致血管通透性升高;某些药物引起机体变态反应性血管炎;重金属(磷、砷、铜)中毒引起的出血;缺氧对毛细血管壁可造成直接损伤等。

  出血是在许多异常情况下出现的一种非常广泛和常见的病理现象,出血不一定是疾病,但出血病一定有出血,如池塘起网过程中,鲢受拉网应激,鱼体表出现片状或点状的出血,此种情景下的鲢虽有出血表现,却不能认定为出血病,因为应激因素消除,鲢即可恢复健康。

  2 鱼类出血病的病因及其特点

  鱼类出血病呈全国性发生,危害程度,高据不完全统计,出血病导致年经济损失超百亿元,该类疾病的高发区域主要集中在我国的华南、华东、华中等地区。淡水鱼和海水鱼类,草食性和肉食性鱼类,有鳞和无鳞鱼均可发生出血病,池塘、池塘网箱、流水养殖也均可发生出血病。该类疾病高发季节一般为春末夏中和夏末秋中,发病水温一般为25℃~35℃之间。生物性因素引发的鱼类出血病占80%~90%,其中病毒性占30%~50%,细菌占30%~50%,寄生虫占5%~10%,而非生物性因素引发的鱼类出血病占10%~20%,这表明细菌性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病占主导地位。

  2.1 常见细菌性出血病

  2.1.1 球菌类:无乳链球菌

  罗非鱼无乳链球菌病严重危害华南地区的罗非鱼养殖,该病每年造成过亿元的经济损失。1966年Robinson,et al.第一次报道在淡水鱼金色美鳊(Notemigonus crysoleucas)中分离出B群链球菌(Group B Streptococcus, GBS),随后相继有包括罗非鱼在内的多种鱼类受无乳链球菌感染而大量死亡的报道。GBS感染罗非鱼的症状主要表现为食欲减退、脊柱移位、眼球出血(图1-A)、角膜浑浊(图1-B)、鳍条基部出血、腹部出血、漫游,剖解可见肛周红肿(图1-C),肝、肾、脾肿大,充血、出血(图1-D),脑膜出血(图1-G),肠浆膜出血(图1-E),肠腔内有黄色透明黏液,肠壁变薄(图1-F)。其中脑部出血是GBS的特征性病变,这主要是由于GBS能通过荚膜多糖逃避宿主免疫清除,并与血脑屏障内皮细胞群粘附,并穿透血脑屏障。因此,GBS于兔血平板不溶血(图1-H)。

  图1 无乳链球菌感染

  2.1.2 杆菌类:鲁氏耶尔森氏菌

  鲁氏耶尔森菌是一种革兰氏阴性棒状细菌(图2-C),能在淡、海水中引起鲑鱼和斑点叉尾鮰等的耶尔森病或肠炎红嘴病(ERM),其特征性症状为嘴部周围明显出血。该菌宿主范围广,多数鲑鱼都易感。该病可水平传播,许多无症状带菌鱼和鸟类都可携带并储备鲁氏耶尔森菌。该病暴发往往由环境压力介导,例如水质变差、水温升高、鱼群分池处理等情况中。在最急性感染中,由于粘膜下层充血而导致口腔和下颌呈现充血的病变,这种病变并不是所有患病鱼都会出现,但该病却因该症状而得名为肠炎红嘴病(图2-A)。解剖病变往往有肠道充血、出血,浆膜有瘀点,脾肾肿大(图2-B),而在感染了鲁氏耶尔森菌的斑点叉尾鮰中还会在腹膜上表现出明显的出血症状(图2-F)。组织病变中,可见出血、充血、水肿,一些组织中(鳃和脑中出现细菌的频率较高)可见定植的细菌。在肾脏肾小球和脾脏中常可见因细菌定植而引起的坏死(图2-D,E)。

  图2 鲁氏耶尔森感染

  嗜水气单胞菌

  嗜水气单胞菌分布十分广泛是气单胞菌败血症的病原。在上个世纪70年代嗜水气单胞菌对养殖经济鱼类的影响非常大,直到80年代开始应用疫苗后情况才有所好转,近期研究发现鲟鱼对该菌易感性较强,其发生急性感染时,其发病率和死亡率都在90%以上。患病鲟体表多处溃疡灶(图3-A),嘴部周围充血、出血(图3-B),性腺、鳔膜出血(图3-C),肝脏肿大(图3-D),腹腔内出现含血腹水(图3-E),组织病理学观察可见病鲟肝细胞出现广泛的空泡变性(图3-F),肾间质炎性水肿(图3-G),间质细胞坏死(图3-G),脾组织出血(图3-H),同时,免疫组化可见病鲟鱼脾脏、肌肉、肾脏等(图3-I,3-J,3-K)组织出现嗜水气单胞菌的阳性信号。

  图3 嗜水气单胞菌感染

  2.2病毒性出血病发病机理

  2.2.1 呼肠孤病毒:草鱼出血病

  早在20世纪50年代,倪达书发现草鱼会发生出血这样的病症,随后以中科院水生生物研究所为代表的科研人员展开一系列草鱼出血病病原学研究,1983年陈燕燊和江育林将草鱼出血病的病原命名为草鱼呼肠孤病毒(Reovirus of grass carp),又称草鱼出血病病毒(Grass Carp Haemorrhage Virus,GCHV)。GCRV不仅能在草鱼自身体内繁殖,而且具有遗传性,它能够在草鱼体内产生合胞体状细胞病变效应(CPE)。此病毒可在GCO、GCK、CIK、ZC-7901、PSF以及GCF等草鱼细胞株内增殖。一般情况下,草鱼在此温度环境下感染病毒12 h以后病毒就开始复制,24~27 h以后病毒开始大量繁殖,侵害机体细胞。

  草鱼感染GCRV后,各脏器小血管内皮受损严重,引起弥散性血管内凝血并形成微血栓,导致循环血量减少,正常代谢功能障碍,最终导致脏器组织病变。草鱼出血病的发病季节长、流行范围广,每年6月中下旬至9月底是主要流行季节,流行高峰一般出现在7月和9月,死亡率高。高密度饲养的鱼种池危害更甚,常造成全池鱼死亡。按病鱼的症状,草鱼出血病大致可分为红鳍红鳃盖型、红肌肉型、肠炎型三种类型,红鳍红鳃盖型病鱼体色发黑,口腔、上下颌、头顶部、眼眶周围、鳃盖有出血点(图4-D,4-E)。

  红肌肉型病鱼外表出血不明显,但剥去表皮可见肌肉呈现点状出血,甚至全身肌肉出血呈鲜红色(图4-F)。肠炎型则表现肠壁充血或出血,肠壁弹性较好,肠内无食物,黏液少,应注意与细菌性肠炎区分(图4-G)。组织病变可见骨骼肌纤维水肿、坏死,红细胞和炎性细胞浸润(图4-H);肝静脉上皮变性,和周围组织分离,胞浆内可见嗜酸性包涵体(图4-I);肾小管上皮细胞肿胀、空泡化、坏死, 官腔中有红细胞(图4-J)。

  图4 草鱼患呼肠孤病毒感染

  2.2.2 疱疹病毒:鲫鱼鳃出血

  鲤科鱼类疱疹病毒病包括锦鲤疱疹病毒病、疱疹病毒性造血器官坏死病、鲤痘疮病,主要危害鲤科鱼类,且均会在鱼体表面产生疱疹样病变。其中,鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)又称疱疹病毒性造血器官坏死病病毒(Herpesviral haematopoietic necrosis virus,HVHNV),能引起的金鱼和鲫鱼的一种高致病性疾病,会对脾、肾等造血器官产生严重破坏,体表严重出血,死亡率高达80%~100%,成世界范围流行,在我国,除有报道江苏异育银鲫感染CyHV-2外,其它地区还未有大规模暴发CyHV-2的文献记录。最早发现鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)的宿主是金鱼,1992年秋日本西部养殖场最早发现金鱼感染CyHV-2并引起大规模死亡,死亡率最高达到100%。随后,1995年台湾地区金鱼苗亦发生CyHV-2感染,通过电子显微镜检测到疱疹病毒颗粒。

  1997年春季美国西岸地区金鱼苗种突发CyHV-2感染并引起死亡,后该病在美国大面积流行,死亡率超过80%。观赏鱼的国际贸易可能已经导致该病毒在全球范围内广泛分布。2002~2004年英国、澳大利亚、新西兰也有金鱼感染CyHV-2报道。鲫鱼作为金鱼的同种祖先是中国内陆地区主要食用淡水鱼之一。近年来,欧洲的匈牙利、捷克等国相继发现野生银鲫被CyHV-2感染并发生严重病害[34]。这是除金鱼外CyHV-2感染鲫鱼并引起爆发流行病害的最早报道。几乎与欧洲病害发生同时我国华东地区陆续发生了异育银鲫“鳃出血”病,并造成严重经济损失,其病原最终也被证实为CyHV-2。

  鲫鱼鳃出血病会出现全身出血症状,尤以鳃部出血最为严重(图5-A,5-B),同时,通过免疫荧光技术能在自然发病鲫鱼鳃(图5-C,5-D)、肝(图5-E,5-F)、脾(图5-G,5-H)、肾(图5-I,5-J)等组织中观察病毒分布。

  图5 鲤疱疹病毒2型感染

  3 鱼类出血病防控关键技术

  3.1诊断技术

  3.1.1免疫学技术

  免疫学技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应,检测病原微生物。目前,用于鱼类疾病诊断的免疫学技术主要有单克隆抗体技术、凝集反应技术、荧光抗体技术、酶免疫技术、胶体金技术等。其中,单克隆抗体技术是利用单抗的特异性、均一性、高效性来进行疾病的诊断,该技术具有快速、简单、灵敏度高的特点,但单克隆抗体的制备方法还有待改进。2013年,连科迅等制备了抗传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)单克隆抗体6G7,该抗体效价高、灵敏度高,特异性强,与天然抗原亲和力强,可用于传染性造血器官坏死病毒的快速诊断。

  另外,荧光抗体技术是在免疫学、生物化学和显微镜的基础上建立起来的一项技术,该技术的优点是特异性强,敏感度高,但对仪器设备要求过高。鄢庆枇等在2006年应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的弧菌。酶免疫技术的方法很多,用于水产动物疾病诊断的主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)技术和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)技术。该方法具有操作简便,灵敏度高,可定量的优点。胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。运用较多的是胶体金免疫层析技术(GICA)和快速斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)。孟小林等在2007用免疫胶体金结合免疫层析法研制了一种快速检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)的试剂条。

  3.1.2 分子生物学技术

  鱼类疾病诊断的分子生物学技术有核酸杂交技术、PCR(聚合酶链式反应)技术、LAMP(环介导等温扩增)技术、限制性酶酶切检测技术、16S rRNA检测技术和基因芯片技术。

  PCR技术是实验室进行鱼病诊断的常规技术和主流技术,用于疾病诊断及其衍生来的PCR技术有常规PCR、套式PCR、多重PCR等。而LAMP技术是一种新的核酸扩增技术,其反应速度快、操作简单,产物检测方便。张金凤等在2013年建立了逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测草鱼出血病病毒的方法,最低检测限为33pg,比PCR方法灵敏度高10倍。基因芯片技术是将大量探针分子固定于支持物上,根据碱基互补配对原理,与标记的样品分子进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。国内外都还处于起步阶段,仅用于诊断一些主要的细菌病和病毒病。

  3.2 对症治疗措施

  3.2.1 化学药物

  虽然人们逐渐发现抗生素治疗非病毒性疾病会伴随环境污染、耐药性等副作用,并且随着科技的进步,出现了越来越多的非病毒性疾病治疗手段,并且终有一天会将其取代。但不可否认,目前抗生素疗法仍然是对抗非病毒性疾病,尤其是细菌病最有效的方法。当爆发细菌性出血病时,应在病原分离鉴定和药敏试验的基础上,在专业人员的指导下,合理、合法地使用抗生素。对于寄生虫性病原,可在合理使用敌百虫或其它类杀虫药进行驱虫。

  3.2.2 中草药

  某些中草药具有收敛、凝固、清营、凉血等作用,可作为止血药用于内因性及创伤性出血。如大蓟、山茶花等。仙鹤草、藕节、山捻子、莲房。黄芪、板蓝根等具有抗病毒和提升机体免疫力的功效,已在水产动物疾病防治实践中上较多应用。

  3.3免疫学方法

  就目前看来,对于控制病毒和细菌等微生物病原引起的常伴有出血的传染病最有效、最有用和最生态的方法仍然还是免疫学的方法。这个方法包括主动免疫学和被动免疫学技术,前者主要是利用疫苗作为抗原接种鱼体,让其体内自行产生能特异性消灭该抗原病原的抗体,后者是直接制成特异性的抗体对鱼体注射或口服,让其进入体内就直接抵抗和灭活病原微生物。尤其是对于病毒性疾病,当前还没有很有效的治疗方法的情况下,免疫学技术还是最重要的防控方法。随着科学技术的发展疫苗制作又可分为传统疫苗和现代生物技术疫苗。

  在水生动物疾病免疫上,传统疫苗仍然是当前使用最多最可靠的疫苗,可分为两个主要类型:弱毒疫苗和灭活疫苗,目前国内已有草鱼出血病弱毒疫苗和灭活疫苗及嗜水气单胞菌灭活疫苗上市。生物技术疫苗重组DNA技术为疫苗学开创了一个全新的领域,重组DNA技术可用于识别和分离抗原,通过克隆和表达病原微生物中部分或全部的抗原,在国外已有疱疹病毒等一批这方面的疫苗面市,国内已有多种这方面疫苗正在研发中,有的已进入临床试验。DNA疫苗的概念是在20世纪90年代初提出的。质粒DNA可以在体内直接转染动物细胞目前一些单位正在研发鲑鳟鱼传染性造血组织坏死病的DNA疫苗,并取得了良好的效果。

  被动免疫是指将抗体从一个机体转移到另一个机体所导致的免疫过程,被动免疫虽不能诱导长期保护,但在病鱼不能及时产生抗体或由于免疫缺陷不能产生抗体的情况下十分有用。卵黄抗体(Immunoglobulin of egg yolk,IgY)是一种存在于禽类,两栖类和爬行类血清中的主要免疫球蛋白,其中以禽类IgY的研究最多。在水产上,由于禽类和鱼类在进化距离上较远,具有较高的抗鱼类抗原活性,鱼类抗原易于刺激禽类的免疫应答,并从禽类卵黄中获得大量多克隆抗体。加上禽类IgY不能识别鱼体内的补体,同时由于禽类与鱼类有着明显的生物学差异,禽类病原体往往对鱼类无致病性,应用相应的禽类IgY抵抗鱼类病原具有很明显的效果。(参考文献略)

  汪开毓,四川农业大学动物医学院院长,教授,主要从事水生动物疾病学研究。主编、副主编和参编《现代禽病诊断与防治全书》、《水生动物病害学(全国统编教材)》、《新编渔药手册》、《鱼病防治与安全用药》、《养鱼全书》、《动物病理学》、《鱼病防治手册》、《水产养殖用药处方大全》、《斑点叉尾鮰疾病彩色诊疗图谱》、《鱼类疾病彩色诊疗图谱》等专著和教材11部。

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